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呼吸是維持所有動物身體機能的重要組成部分。因此，當氧氣穩(wěn)定狀態(tài)被破壞時，身體往往會通過調(diào)整呼吸參數(shù)來做出反應。然而，在斑馬魚胚胎或幼魚等小型生物中，客觀地測量呼吸運動已被證明是困難的。
本文將探討海德堡大學的研究人員對我們的產(chǎn)品斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)的新穎應用。Nadine K?mmer和她的同事使用斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)客觀地測量斑馬魚的呼吸運動，并將這種方法與手動評估進行了比較[1]。

為什么不手動測量呼吸？
維持氧氣穩(wěn)態(tài)非常重要，因為氧氣是通過產(chǎn)生有氧能量以維持細胞代謝所必需的。當暴露在低氧環(huán)境（缺氧）中時，魚類往往會增加呼吸動作，以增強氧氣提取。相反，當暴露在高氧環(huán)境（高氧）中時，他們會通過減少呼吸來節(jié)省能量，這也可以防止過量的氧氣攝入，從而防止氧化應激。然而，這種呼吸頻率降低的潛在負面影響是血液中二氧化碳的積聚，導致酸中毒。
由此我們可以得出，呼吸是魚類對環(huán)境生理反應的良好指標。然而，手動計算斑馬魚的呼吸既耗時，又不可靠。可靠性問題在一定程度上使人工計數(shù)在現(xiàn)代科學時代變得不可行。


缺乏良好的客觀方法
雖然客觀的衡量標準確實存在，但對于大多數(shù)研究來說，它們并不是最佳的。將電極連接到鰓蓋（為鰓提供結構支撐和保護的骨骼）進行了研究。然而，這種方法非常具有侵入性，只適用于較大的魚類，而不適用于胚胎和幼魚。
電極也以非侵入性的方式被用于檢測由生物電信號介導的水電導率的變化。然而，由于魚胚胎的大小，它們的身體運動會干擾呼吸運動的檢測，因此不適合對魚胚胎進行研究。

每一次呼吸，都會測量
Nadine K?mmer和她的同事著手解決這個問題。為了比較斑馬魚不同生命階段的呼吸運動和反應，對4天大的斑馬魚胚胎和12天大的幼魚進行了測量。魚類短期暴露于（1小時）水中不同濃度的lindane（引起呼吸壓力的神經(jīng)毒性農(nóng)藥）、溶劑對照組中。
視頻記錄是在魚胚胎被麻醉的同時進行的，以防止身體運動干擾測量。將魚轉(zhuǎn)移到凝膠袋中后，對其進行2分鐘的馴化，然后在顯微鏡下以每秒25幀的幀速率對魚進行視頻跟蹤。
這些視頻隨后被用于手動計數(shù)以及斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)中的分析。人工計數(shù)是由兩名觀察者通過觀察魚的嘴或蓋來完成的。在這里，一口氣被定義為其中一個身體部位的運動（取決于魚的方向）。


斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)的新穎應用
為了便于客觀測量，使用了Noldus的斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)。最初，斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)被設計用于自動檢測早期斑馬魚的活動。它可以測量許多參數(shù)，如：爆發(fā)活動/持續(xù)時間、不活動，但也可以測量更具體的生理參數(shù)，如尾巴卷曲和血液/腸道流量。
由于斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)沒有內(nèi)置的呼吸檢測功能，研究人員必須進行一些前處理和后處理步驟?？傊麄儗氲囊曨l幀速率必須保持不變，因為斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)無法處理不規(guī)則的幀速。然后，必須在程序中繪制感興趣的區(qū)域，然后為本研究優(yōu)化檢測設置。關于K?mmer等人采取的確切步驟，請參閱他們的文章。


接下來該如何做？
一般來說，斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)的測量顯示，與手動計數(shù)相比，壓力魚的呼吸頻率要高得多。這可能意味著手動計數(shù)可能會錯過呼吸動作的情況，尤其是在lindane濃度較高的情況下，當呼吸頻率急劇增加，動作變得快速和不規(guī)則時。此外，在這些情況下，人工計數(shù)低估了呼吸頻率高達250%。
有了斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)的這一新應用，研究人員能夠成功測量斑馬魚幼魚和胚胎的呼吸頻率和振幅。這些客觀的測量方法在斑馬魚研究中，特別是在毒理學和藥理學方面非常有價值。它使研究人員能夠看到某些物質(zhì)和藥物在不同生命階段的影響，而這在以前是不可能的。
K?mmer等人最后表示，雖然使用斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)進行這一分析需要一些步驟，但這是一個值得進一步研究和驗證的有趣課題。此外，手動設置感興趣區(qū)域也可用于檢測斑馬魚的其他小動作，如眼球運動或塑料顆粒通過腸道或鰓。


參考文獻
1. K?mmer, N.; Reimann, T.; Ovcharova, V.; Braunbeck, T. A Novel Automated Method for the Simultaneous Detection of Breathing Frequency and Amplitude in Zebrafish (Danio Rerio) Embryos and Larvae. Aquat. Toxicol. 2023, 258, 106493.


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